En enero de 1936 el POUM firmó el pacto electoral del Frente Popular español, contribuyendo a su victoria en las elecciones de febrero, abriendo una nueva etapa política.

Cuando en julio de 1936 estallaba la guerra civil española, el POUM seguía siendo, como en sus orígenes, una pequeña organización marxista revolucionaria.
Liderada por dos intelectuales de prestigio - Joaquín Maurín y Andrés Nin -, con una importante presencia en Cataluña y con núcleos militantes por Valencia, Asturias, Extremadura, Andalucía, Santander, Galicia y el País Vasco.
Mientras que en Cataluña y Valencia la mayoría de los militantes procedían del BOC de Joaquín Maurín, en el resto del Estado procedían sobre todo de la IC de Andrés Nin.

A escala internacional, el POUM se mantuvo distanciado de las grandes internacionales obreras, y después de que IC hubiese roto con Trotski y con el trotskismo después de una dura polémica iniciada en 1932, se unió al Comité Internacional por la Unidad Socialista Internacional (con sede en Londres), que agrupaba a una serie de organizaciones socialistas independientes (entre otros, Independent Labour Party británico o el partido Obrero Socialista Revolucionario holandés), cuyo objetivo principal era reagrupar a todos los partidos marxistas desgajados de la socialdemocracia y del stalinismo que seguían manteniendo postulados revolucionarios en su actuación programática.

Cuando estalló la guerra civil, el POUM se encontraba en una fase de estructuración y organización interna.
Por otra parte, a las pocas semanas de iniciada la guerra, el POUM perdía a su secretario general, Joaquín Maurín, que había sido detenido en Aragón por la policía franquista cuando regresaba de una asamblea de militantes gallegos del POUM.

A pesar de todo, el POUM supo adaptarse a la nueva situación con los mismos planteamientos programáticos de su fundación.
Aseguró la unidad de las organizaciones obreras y antifascistas, participó en multitud de organismos que se formaron en la zona republicana, y se movilizó por todo el país contra la sublevación (entre otros sitios, Barcelona, Extremadura, Galicia, Lérida, Madrid, Oviedo y Valencia).
En Cataluña, donde tenía mayor arraigo, formó parte del Comité Central de Milicias Antifascistas de Cataluña (constituido el 21 de julio de 1936)

El POUM, como hiciera el resto de las organizaciones políticas y sindicales, creó sus propias milicias combatientes. La 'división Lenin', entre cuyos jefes militares destacó Josep Rovira, fue a combatir al frente de Aragón en los primeros días de la guerra.

El POUM respondiendo a su lógica revolucionaria, vio en las milicias obreras, un ejército proletariado basado en la igualdad entre sus componentes, opuesto al ejército convencional.

A principios de septiembre de 1936, tras la desaparición de Maurín, Andrés Nin se había convertido en el máximo dirigente del POUM.
La defensa intransigente de posiciones revolucionarias a lo largo de la guerra - coincidiendo con la CNT y la FAI - acarrearon al POUM bastantes problemas con el resto de organizaciones políticas antifascistas.

La euforia revolucionaria duró pocas semanas, se había creado una situación de doble poder, las instituciones republicanas y las instituciones revolucionarias.

Esta situación no beneficiaba a las fuerzas republicanas empeñadas en derrotar al fascismo en el campo de batalla.
Con la intención de regresar a la situación anterior al levantamiento militar, los republicanos, socialistas y comunistas hicieron una piña en común.

En un primer paso hacia la recomposición de la legalidad republicana, el 4 de septiembre de 1936, Largo Caballero incorporaba en la composición del XXIII gobierno republicano a socialistas, republicanos y comunistas; en el XXIV gobierno del 4 de noviembre de 1936 incorporaría también a ministros anarquistas.

Esta situación afectó directamente al POUM, que a pesar de defender que era un paso hacia adelante respecto al XXII gobierno republicano de José Giral, mantenía que la República seguía respondiendo como si no hubiera estallado la revolución. Para el POUM el único gobierno era una 'gobierno sin ministros, un gobierno puramente obrero'.

Cuando la cuestión se presentó en Cataluña a primeros de septiembre de 1936, el POUM manifestó que el nuevo gobierno de la Generalitat debía ser un gobierno obrero, fundamentado en la democracia proletaria sin exclusión de ninguna organización obrera, y con un programa socialista o de transición al socialismo.

Ante los acontecimientos, cuando la CNT y la FAI aceptaron formar parte de los gobiernos republicanos de Madrid y Barcelona, el Comité Central del POUM se vio abocado a cambiar de opinión el 15 de septiembre de 1936, imponiendo dos condiciones para formar parte del gobierno: La participación en él de la CNT y de la FAI, y el mantenimiento de un programa inequívocamente socialista.

El 26 de septiembre de 1936, Andrés Nin, en representación del POUM, entró a formar parte del gobierno de la Generalitat como Consejero de Justicia, siendo éste el único gobierno que durante la guerra estuvieron representadas todas las fuerzas políticas y sindicales antifascistas.
Cuando Andrés Nin tomó posesión de su cargo de Consejero de Justicia, declaró que 'Vengo a legalizar y recoger lo que han hecho las masas trabajadoras en la calle', y cuando dio cuenta de la creación de los "Tribunales Populares" para la represión del fascismo, manifestó que 'Ahora la Justicia esta al servicio de la clase trabajadora revolucionaria, el nuevo Tribunal Popular tiene como obligación primordial garantizar la integridad de las conquistas proletarias'.

La presencia del POUM en el gobierno catalán era una garantía para el mantenimiento de la revolución, manteniendo una existencia legal, no se aislaban de las masas anarquistas, hegemónicas en Cataluña, y a las que esperaban influir con su política.

El POUM defendía un programa revolucionario intransigente, con una actitud muy crítica respecto a la Unión Soviética y Stalin. Estos hechos se habían puesto de relieve en agosto de 1936 cuando denunció públicamente los procesos realizados en Moscú contra la vieja guardia bolchevique, o cuando crítico a Stalin por haber retrasado su ayuda a la República tras haber firmado el Pacto de No Intervención.

El POUM, a la izquierda del comunismo oficial del PCE y del PSUC, competía con éstos para ocupar el mismo espacio político.
Este hecho abrió una campaña del comunismo oficial del PCE y PSUC, que se estaban convirtiendo en los artífices de la reconstrucción de las instituciones republicanas, acusando al POUM de traición y de ultraizquierdismo.
Por otro lado, Trotski acusó también al POUM (en especial a Nin y a Andrade) de haber traicionado a la clase obrera participando en un gobierno burgués.

Desde el 7 de octubre de 1936 se inició una campaña contra el POUM, bien desde el gobierno soviético donde se decía que 'los trotskistas españoles intentaban romper al Frente Popular; sembrando la desconfianza hacia el Gobierno', o desde Madrid, donde el local de la Juventud Comunista Ibérica fue asaltado por militantes de las Juventudes Socialistas Unificadas.
La campaña del PCE y PSUC fue determinante para el futuro del POUM, a mediados de diciembre de 1936 se excluyó a Nin del gobierno de la Generalitat.

 A principios de enero de 1937, después de ser excluido de la Generalitat, el POUM se manifestó partidario de los comités obreros, campesinos y combatientes, y de la constitución de una asamblea constituyente en dichos comités que debería sustituir a los Parlamentos de la República.

La campaña contra el POUM se fue agudizando, en febrero de 1937 era incautada 'Radio POUM' en Madrid, mientras el diario 'El Combatiente Rojo' fue suspendido.

Entre los días 3 y 7 de mayo de 1937 estalló una 'guerra catalana' en plena guerra civil, Generalitat, republicanos y PSUC enfrentados contra militantes de la CNT - FAI y del POUM. Se ha escrito mucho sobre estos acontecimientos, las interpretaciones varían según la ideología política.
Para la Generalitat, republicanos y PSUC se trató de un putsch anarcotrokskista destinado a desestabilizar a la República.
Para la CNT - FAI y el POUM se trató de una maniobra para paralizar la revolución, acabar con el predominio de la CNT y eliminar al POUM.

Sin entrar en ninguna valoración, lo cierto es que esos días fueron la culminación de un proceso de divergencias y enfrentamientos iniciados a principios de 1937.

El POUM intentó negociar con la CNT la creación de un organismo común que dirigiese la lucha, con el objeto de reconquistar el poder para la clase obrera.
La tentativa se fue al traste con la negativa de algunos importantes cenetistas y la llegada a Barcelona de dos ministros de Largo Caballero (Federica Montseny Mané y Juan García Oliver) que apelaron por la calma y la vuelta al trabajo.

Indiscutiblemente los hechos acaecidos en mayo representaron una evolución política importante, con la caída del gobierno de Largo Caballero abandonan el gobierno los cenetistas, y el 17 de mayo de 1937 se formó el XXV gobierno republicano de Juan Negrín López, que tomó progresivamente el control político de Cataluña.
La formación del gabinete de Juan Negrín supondría la liquidación del POUM como partido legal.
El PCE y el PSUC con el objetivo exigir la disolución del POUM, le presentaron como un partido fascista, acusándole de ser el único responsable de los acontecimientos ocurridos en el mayo barcelonés.

'La Batalla' (periódico del POUM) es clausurado el 28 de mayo de 1937, aunque posteriormente aparecería clandestinamente.

El 15 de junio de 1937 el gobierno republicano decretaba la disolución del POUM y al día siguiente su Comité Ejecutivo era detenido en Barcelona, después siguió la disolución de la XXIX División militar del Frente de Aragón (formada por militares poumistas), la exclusión del POUM de los ayuntamientos catalanes, la clausura su abundante prensa, y la detención de muchos de sus militantes.