En 1502, procedentes de Flandes, Juana y Felipe llegaron a Castilla para ser reconocidos como herederos. El 22 de mayo de 1502 se celebró la ceremonia en Toledo.
El 27 de octubre de 1502, las Cortes de Aragón, reunidas en Zaragoza, les juraron como herederos del reino.

Felipe 'El Hermoso' abandonó Castilla en 1503, dejando a Juana que comenzaba a dar muestras de locura.
Ante la situación de enemistad entre Felipe y Fernando 'El Católico', Juana embarca en 1504 camino de Flandes. La conducta de su esposo Felipe da pie a los continuos celos de Juana, precipitándose cada vez más hacia un estado de locura.

Isabel 'La Católica' muere el 26 de noviembre de 1504, dejando en su testamento como Regente de Castilla a su esposo Fernando II, en caso de que Juana fuera incapaz de gobernar.

Por otra parte, Fernando 'El Católico' concierta su matrimonio con la francesa Germana de Foix.
El matrimonio levanta las iras de los nobles de Castilla, que se pasan al partido del borgoñón en contra de Fernando, con lo cual la unidad de los reinos estaba francamente amenazada.

Juana y Felipe regresan a Castilla en 1505, estableciéndose unas negociaciones con Fernando 'El Católico' para que éste junto a Felipe 'El Hermoso' gobernasen conjuntamente Castilla, tras declarar la incapacidad de Juana 'La Loca'.
Parte de la nobleza castellana se opuso a Fernando 'El Católico', obligándole a retirarse a Aragón.
Felipe I quedó gobernando en Castilla, tratando por todos los medios que las Cortes de Castilla declararan la incapacidad de Juana, para poder asumir con legitimidad la Corona de Castilla, pero las Cortes se lo negaron.

Felipe I 'El Hermoso' gobernó Castilla durante breve tiempo, reinado caracterizado por el reparto de prebendas y favores. La muerte le sorprendió en Burgos a los veintiocho años el 25 de noviembre de 1506.

Tras la muerte de Felipe I, la enfermedad mental de Juana se agravó y su padre Fernando II tuvo que asumir la Regencia de Castilla, aunque es mantenida como Reina de Castilla.

En 1507 se produce una escena dramática, cuando por una epidemia de peste en Burgos, Juana tiene que abandonar la ciudad, llevándose con ella el féretro de su esposo que había sido enterrado en la Cartuja de Miraflores.

En el largo peregrinar desde Burgos a Tordesillas, la comitiva fúnebre se tiene que detener en Torquemada para que la Reina de a luz a su hija Catalina.
La comitiva llegó a Tordesillas en 1509, siendo enterrado el cadáver de Felipe I en Santa Catalina, y Juana se instala en el Castillo de Tordesillas, lugar donde permaneció el resto de su vida.

Fernando 'El Católico' regresó a Tordesillas en 1510 para visitar a su hija Juana. Tras la muerte del rey católico, llegó a Castilla el príncipe Carlos, haciéndose coronar con el título de Rey.

Aunque las Chancillerias aceptaron la situación, en los documentos debía figurar en primer lugar el nombre de la reina Juana. Para ello, Chiévres consiguió que la reina aceptase la cesión del gobierno en manos de su hijo Carlos.
A partir de este momento, la reina Juana permaneció en estado de cautiverio bajo la custodia de Don Bernardo Sandoval y Rojas, marqués de Denia, que actuó como su carcelero hasta su muerte el año 1535; en el cargo de custodia le sucedió su hijo Luis.

La figura de Juana paso a un primer plano en el movimiento de las Comunidades, convirtiéndose en la abanderada de los comuneros. La Junta de Comunidades reunida en Ávila presentó el propósito de que la reina presidiera el Consejo de Castilla, y un grupo de sus representantes se dirigieron a Tordesillas para que la reina firmara sus pretensiones.
El intento fracasó y, aunque fueron recibidos por la reina, ésta se negó a firmar ningún documento.
En 1520 las tropas reales entraban en Tordesillas. Desde este momento y hasta su muerte en 1555 la vida de la reina transcurrió en la monotonía de su permanente locura.

Juana en su muerte fue asistida por Francisco de Borja, que dio fe de la claridad de juicio con que murió, frente a la enajenación que la había acompañado durante toda su vida.
Su cuerpo fue depositado junto a su esposo en el convento de Santa Clara de Tordesillas, hasta que fue trasladado, en 1573, a la Capilla Real de Granada.